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第三节 血小板血型抗原抗体检测方法（第2页）

（1）取上述血小板悬液0。4ml加抗人球蛋白血清试剂0。4ml，放置37℃水浴15分钟。

（2）取出滴定抗人球蛋白消耗效价（以不完全抗D抗体血清所致敏的O型Rh阳性红细

胞），其方法如下述的间接法。

（3）正常人的血小板作对照，处理方法同上。

3．结果分析血小板抗人球蛋白消耗效价，低于抗人球蛋白效价3管者为阳性，对照管不被消耗。

（二）间接法

1．材料

（1）2%EDTA-2Na盐水溶液；

&A生理盐水缓冲溶液；

（3）抗人球蛋白血清；

（4）抗Rh（D）不完全抗体。

2．操作

（1）血小板悬液制备，取正常人血清10-20ml，分离制备悬液操作同直接法。

（2）致敏，受检者血清分离后56℃灭活30分钟，取15mm×125mm试管4支分别编号为①、②、③、④，并在①管中放入受检者血清0。4ml加血小板悬液0。2ml，在②管中加对照AB型血清0。4ml加血小板悬液0。2ml，在③管中加对照盐类水0。4ml加血小板悬液0。2ml，在④管中加不完全抗D血清1。2ml加压积RH阳性红细胞0。6ml，分别混合后，放置37℃水浴中1小时。

（3）取出后将①、②、③管用EDTA生理盐水缓冲溶液洗涤5次，将④管用盐水洗涤3次，用以滴定抗人球蛋白的效价，将压积红细胞加生理盐水配成5%悬液备用。

（4）①、②、③管经洗涤之血小板悬液加等量抗人球蛋白血清，放置37℃15分钟，以2000rmin，离心10分钟取上清液备用。

（5）滴定度比较，取10mm×60mm试管40支，排成4排，分别标明，第1排抗人球蛋白，第2排受检者，第3排正常对照，第4排盐水对照，每管各加盐水0。2ml。第1排作测定抗人球蛋白效价，吸取抗人球蛋白血清0。2ml于第1管，并连续稀释至第10管弃去0。2ml；第2排第1管中加原来①管内的上清液0。2ml，并并连续稀释至第10管弃去0。2ml；第3排管1管中加原来②管内的上清液0。2ml，并连续稀释至第10管弃去0。2ml；第4排第1管中加原来③管内的上清液0。2ml，并连续稀释去第10管弃去0。2ml，最后每管各加致敏红细胞悬液1滴，混合后放在37℃水浴中15分钟，观察结果。

3．结果分析血小板抗人球蛋白消耗效价如低于抗人球蛋白效价3管时为阳性，对照无消耗。

三、聚合酶链反应

聚合酶链反应（PCR技术）在血小板血型基因定型、分型中的应用。

1．原理PA复制原理而设计的体外DNA扩增方法，其全过程是：

①DNA模板的变性（解链）；②与附加引物退火；③引物延伸（扩增步骤）。经过30次循环后，可使靶DNA量放大100万倍，用于检测微量的DNA。

目前，常用的方法有PCR-电泳法，测定血小板HPA1-A4血型系统抗原；PCR-ELISA法，测定血小板HPA1-A5血型系统抗原；PCR-RFLP（限制性片段长度多态性）等方法。

2．PCR-电泳法是最简单、常用的测定血小板抗原基因型的方法。

（1）DNA分离：取500l全血，加入红细胞溶解液处理2次，再加入蛋白溶液55℃的依数性处理20分钟，用500l异丙醇抽提沉淀，用70%乙醇洗涤，干燥去除残留的乙醇，加入生理盐水200l溶解，即为DNA标本。

（2）引物合成：预先合成用于血小板同种抗原测定的引物序列，其序列可见相关文献报道。

（3）扩增：分离得到的DNA标本10l与dNTP、TaqDNA聚合酶、合成引物及PCR缓冲液混合，用蒸馏水调节到40l，反应循环的时间和温度如下：变性94℃1分钟，退火69℃1分钟，引物延伸72℃1分钟，30个循环。

（4）产物鉴定：PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，100V20分钟。凝胶放在紫外光下观察DNA条带，记录结果，见表5-3。

3．优越性不需要特异性抗体和血小板，可用尿沉淀物、口腔黏膜细胞和羊水细胞作为基因组DNA的来源，该技术在条件较好的医院可以开展。